Un certificado de análisis responde a dos preguntas distintas que con frecuencia se presentan como una sola. La primera es cuánto: qué proporción del material corresponde al compuesto de interés. La segunda es qué: si ese compuesto es efectivamente el que figura en la etiqueta.
La cromatografía líquida con detección ultravioleta responde muy bien a la primera y nada a la segunda. Ve picos y mide áreas, pero no sabe qué molécula hay debajo de cada pico. Para eso existe la espectrometría de masas, y es la parte del certificado que más merece leerse con atención.
Nota de alcance: se trata de material de uso exclusivo en investigación de laboratorio (RUO). Lo que sigue es método analítico, no indicación de uso.
Qué mide realmente un espectrómetro
Un espectrómetro de masas no pesa moléculas: mide la relación entre su masa y su carga, m/z. En la técnica habitual para péptidos, la ionización por electroespray acoplada a cromatografía líquida (LC-MS), las moléculas salen del cromatógrafo, captan protones y entran al analizador cargadas.
Eso tiene una consecuencia práctica que confunde a quien lee un espectro por primera vez: un mismo péptido aparece en varios valores. Con un protón, en m/z = (M + 1,0073); con dos, en (M + 2 × 1,0073) / 2; y así sucesivamente. Cuanto más grande el péptido, más cargas tiende a captar.
Monoisotópica y molar: no confundirlas
La masa molar que figura en una ficha técnica promedia la abundancia natural de los isótopos de cada elemento. Un espectrómetro de alta resolución separa esos isótopos y mide la masa monoisotópica, la de la molécula formada solo por el isótopo más abundante de cada elemento. Para comparar, hay que usar la cifra correcta.
Dos ejemplos calculados a partir de la fórmula de compuestos de nuestro catálogo:
| KPV | MOTS-c | |
|---|---|---|
| Fórmula | C₁₆H₃₀N₄O₄ | C₁₀₁H₁₅₂N₂₈O₂₂S₂ |
| Masa molar | 342,44 | 2174,6 |
| Monoisotópica | 342,2267 | 2173,1077 |
| [M+H]⁺ | 343,2340 | 2174,1150 |
| [M+2H]²⁺ | 172,1206 | 1087,5611 |
| [M+3H]³⁺ | — | 725,3765 |
| [M+4H]⁴⁺ | — | 544,2842 |
En KPV, un tripéptido pequeño, el pico dominante suele ser el monocargado. En MOTS-c, de dieciséis residuos, lo habitual es ver sobre todo las especies con tres y cuatro cargas. Un informe que muestre solo un pico a 2174 para MOTS-c no está mal, pero un espectro donde las especies multicargadas encajan entre sí a la misma masa neutra es una confirmación más robusta.
En una molécula de unos 2 kDa la diferencia entre monoisotópica y molar supera el dalton y medio: comparar la cifra observada con la que no corresponde produce un «error» que en realidad es una confusión de definiciones.
Las diferencias de masa que delatan un problema
Una vez localizado el pico principal, lo útil es mirar los picos cercanos. Muchas impurezas de péptidos sintéticos tienen firmas de masa reconocibles, y la revisión de Lian y colaboradores sobre caracterización por LC-MS las sistematiza según su origen: materias primas, proceso de síntesis y almacenamiento.
| Diferencia respecto al pico principal | Lo que suele indicar |
|---|---|
| +15,995 | Oxidación, típicamente de metionina |
| +0,984 | Desamidación de asparagina o glutamina |
| Menos la masa de un residuo | Secuencia de deleción: un aminoácido que no se acopló durante la síntesis |
| Más la masa de un residuo | Inserción: un aminoácido acoplado dos veces |
| +21,982 respecto a [M+H]⁺ | Aducto de sodio; no es una impureza del material, es un artefacto de la medida |
| +37,956 respecto a [M+H]⁺ | Aducto de potasio; mismo caso |
La oxidación merece una nota aparte. MOTS-c tiene metionina en las posiciones 1 y 6, de modo que un pico a +16 o a +32 es exactamente lo que cabría esperar si el material se almacenó con exposición al aire o se manipuló en solución demasiado tiempo. Por eso el dato de identidad tiene fecha: describe el lote cuando se midió.
La desamidación es más difícil de ver a baja resolución, porque menos de un dalton se confunde fácilmente con el segundo pico isotópico del propio compuesto. Es un caso donde la resolución del equipo deja de ser un detalle técnico.
Lo que la masa sola no puede ver
La espectrometría de masas tiene un punto ciego de fondo: no distingue moléculas con la misma masa exacta.
- Leucina frente a isoleucina. Tienen la misma fórmula. MOTS-c contiene una isoleucina en posición 9 y una leucina en posición 15; un intercambio entre ellas no cambiaría la masa en nada.
- Aminoácidos D frente a L. Un diastereómero, el mismo péptido con un residuo de configuración invertida, tiene masa idéntica. La revisión de Lian dedica atención específica a estos epímeros precisamente porque son la impureza que la masa no delata.
- Isómeros de posición, cuando la misma modificación puede caer en sitios distintos.
Para estos casos hacen falta herramientas complementarias: la separación cromatográfica, que a menudo resuelve diastereómeros como picos distintos; la fragmentación en tándem (MS/MS), que rompe el péptido y permite leer la secuencia por los fragmentos; o métodos quirales específicos. El estudio de Breindahl y colaboradores sobre melanotan II es un buen ejemplo de identificación seria: no se conformó con la masa del ion precursor, sino que exigió el tiempo de retención correcto y la proporción relativa de cinco iones fragmento.
Qué pedir y cómo leerlo
Un informe de identidad útil contiene, como mínimo:
- El valor observado y el teórico, indicando si son monoisotópicos o promedio.
- La especie que se midió: [M+H]⁺, [M+2H]²⁺ o la masa neutra deconvolucionada.
- La tolerancia aplicada, en ppm o en Da, coherente con el equipo.
- El espectro, para ver qué hay además del pico principal.
- La fecha y el número de lote.
Sobre la tolerancia conviene saber qué esperar. Un equipo de baja resolución, como un cuadrupolo simple, confirma la masa con un margen de unas décimas de dalton: suficiente para descartar un compuesto equivocado, insuficiente para ver una desamidación. Uno de alta resolución trabaja en partes por millón y sí la resuelve. Ninguno de los dos es incorrecto; lo que importa es que el informe diga cuál se usó.
Lo que no sirve es la palabra «conforme» sin cifras. La guía ICH Q2(R2) sobre validación de procedimientos analíticos establece que un método de identificación debe demostrar especificidad: que distingue el compuesto de otros parecidos. Un «conforme» sin datos no permite saber si se demostró nada.
Para el resto del certificado —pureza, contenido peptídico y endotoxinas— el punto de partida es cómo leer un certificado de análisis, y la diferencia entre lo que mide la HPLC y lo que hay en el vial está en pureza HPLC frente a contenido peptídico.
Fuentes
- Lian Z, Wang N, Tian Y, Huang L. Characterization of Synthetic Peptide Therapeutics Using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry: Challenges, Solutions, Pitfalls, and Future Perspectives. J Am Soc Mass Spectrom. 2021;32(8):1852-1860. doi:10.1021/jasms.0c00479. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34110145/
- Sharma N, Kukreja D, Giri T, Kumar S, Shah RP. Synthetic pharmaceutical peptides characterization by chromatography principles and method development. J Sep Sci. 2022;45(13):2200-2216. doi:10.1002/jssc.202101034. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35460196/
- Breindahl T, Evans-Brown M, Hindersson P, et al. Identification and characterization by LC-UV-MS/MS of melanotan II skin-tanning products sold illegally on the Internet. Drug Test Anal. 2015;7(2):164-172. doi:10.1002/dta.1655. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24771717/
- International Council for Harmonisation. ICH Q2(R2) Validation of Analytical Procedures (2023). https://database.ich.org/sites/default/files/ICH_Q2%28R2%29_Guideline_2023_1130.pdf